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小鼠ELISA試劑盒的雙抗體夾心法

更新時(shí)間:2025-07-10    點(diǎn)擊次數(shù):24

  小鼠ELISA試劑盒的雙抗體夾心法

  以下是本生對(duì)小鼠ELISA試劑盒雙抗體夾心法的詳細(xì)操作流程及關(guān)鍵要點(diǎn),綜合多來源實(shí)驗(yàn)方案整理:

  一、實(shí)驗(yàn)原理

  通過兩種特異性抗體(包被抗體與酶標(biāo)抗體)分別結(jié)合抗原的不同表位,形成"固相抗體-抗原-酶標(biāo)抗體"復(fù)合物,最終通過酶催化底物顯色定量抗原濃度?。

  二、操作步驟

  包被抗體固定?

  用包被緩沖液稀釋抗體至1-10μg/mL,每孔加入100μL,4℃過夜或室溫孵育3小時(shí)?。

  甩盡孔內(nèi)液體,用PBST洗滌3次(每次浸泡3分鐘,拍干)?。

  封閉非特異性位點(diǎn)?

  加入200μL含5%脫脂奶粉的PBST封閉液,室溫孵育1小時(shí)?。

  再次洗滌3次,去除未結(jié)合封閉蛋白?。

  加樣與孵育?

  標(biāo)準(zhǔn)品?:梯度稀釋(通常S1-S7)后每孔加100μL,從低濃度到高濃度懸空加入?。

  樣本?:離心取上清,每孔加50-100μL,覆膜后37℃孵育90分鐘?。

  酶標(biāo)抗體反應(yīng)?

  加入生物素化抗體工作液100μL/孔,37℃孵育60分鐘,洗滌5次?。

  加入HRP標(biāo)記鏈霉親和素(按1:100稀釋),避光孵育20分鐘?。

  顯色與終止?

  每孔加TMB底物90μL,避光反應(yīng)15-30分鐘(顯藍(lán)色梯度)?。

  加入50μL終止液(2M硫酸),藍(lán)色立即轉(zhuǎn)黃色,450nm測(cè)OD值?。

  三、關(guān)鍵注意事項(xiàng)

  標(biāo)準(zhǔn)品處理?

  需離心(10,000g, 1min)后梯度稀釋,渦旋混勻避免濃度誤差?。

  洗滌控制?

  自動(dòng)洗板機(jī)建議設(shè)置浸泡30秒程序,手動(dòng)洗板需拍干并更換吸水紙區(qū)域?。

  加樣技巧?

  使用多通道移液器垂直懸空加樣,不同濃度/樣本需更換吸頭?。

  四、數(shù)據(jù)分析

  以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)(log值)、OD450為縱坐標(biāo)繪制曲線,計(jì)算樣本濃度?。

  若使用雙波長校正,需從450nm值中減去630nm或570nm背景值?。

  注:以上資料僅供參考,完整操作請(qǐng)以實(shí)說明為準(zhǔn),不同品牌可能存在細(xì)節(jié)差異?。

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